植物细胞悬浮培养用培养摇床的实验方法-摘抄细胞悬浮培养技术

植物细胞悬浮培养用培养摇床的实验方法
1.用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织,放入三角瓶中并轻轻夹碎.每100ml三角瓶含灭过菌MS培养基10~15ml,每瓶接种1~1.5g愈伤组织,以保证zui初培养物中有足够量的细胞.
2.将已接种的三角置于旋转式摇床上.在100r/min,25~28℃条件下,进行振荡培养.
3.经6~10天培养后,若细胞明显增殖,可向培养瓶中加新鲜培养基10ml,必要时,可用大口移液管将培养物分装成两瓶,继续培养.（若细胞无明显增殖,可能是起始材料不适当,应考虑用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种）.可进行*次继代培养.
4.县浮培养物的过滤：按“3”法继代培养几代后,培养液中应主要由单细胞和小细胞团（不多于20个细胞）组成.若仍含有效大的细胞团,可用适当孔径的金属网筛过滤,再将过滤后的县浮细胞继续培养.
5.细胞计算.取一定体积的细胞县液,加入2倍体积的8%的三氧化铬（CrO3）,置700C水浴处理15min.冷却后,用移液管重复吹打细胞悬液,以使细胞充分分散,混匀后,取一滴县液置入血细胞计数板上计数.
6.制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态,可用以下方法绘制生长曲线图：
（1）鲜重法（fresh weigh method）
在转代培养的不同时间,取一定体积的悬浮细胞培养物,离心收集后,称量细胞的鲜重,以鲜重为纵座标,培养时间为横座标,绘制鲜重增长曲线.
（2）干重法（dry weigh method ）
可在称量鲜重之后,将细胞进行曲烘干,再称量干重.以干重为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制细胞干重生长曲线.
上述两种方法均需每隔2天取样一次,共取7次,每个样品重复三次,整个实验进行期间不再往培养瓶中换入新鲜培养液.
7.细胞活力的检查.对于初学者,往往需要检测活细胞的比率.可在培养的不同阶段,吸取一滴细胞县液,放在载玻片上,滴一滴0.1%的酚藏花红溶液（用培养基配制）染色,在显微镜下观察.几活细胞均不着色,而死细胞则很快被染成红色.也可用0.1%荧光双醋酸酯溶液染色,凡活细胞将在紫外光诱发下显示蓝绝色荧光,有经验的操作者,则可根据细胞形态,胞质环流判别细胞的死活.
8.细胞再生能力的鉴定：为了解悬浮培养细胞是否仍具有再生能力,可将培养细胞转移到琼脂固化的培养基上,使基再形成愈伤组织,进而在分化培养基上,诱导植株的分化.